海洋灰绿曲霉AgveA基因响应盐度胁迫的功能分析

李佳欣, 刘绍梅, 任燕娜, 周祥山, 蔡孟浩, 张元兴

(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室, 上海 200237)

摘要通过染色体步移方法克隆了基因AgveAAgfphAAglreAAglreB的上下游侧翼序列,并通过逆转录确定了各个基因的内含子序列。通过实时荧光定量PCR发现,基因AgveA转录受盐度胁迫的作用下调较明显,而AgfphAAglreAAglreB上调较明显。通过构建打靶质粒以敲除AgveA,最终成功构建了基因缺失株ΔAgveA,并从菌丝形态、菌落形态、菌丝生长速率和细胞发育表型4个方面进行了基因功能分析。结果表明,菌株ΔAgveA的菌丝形态并未产生明显变化,而菌落的边缘存在残缺,菌丝生长速率在生长后期加快;细胞发育模式产生明显改变,AgveA基因的缺失导致海洋灰绿曲霉在高盐度胁迫条件下子囊果的合成完全受阻,而在低盐度胁迫条件下产生分生孢子的同时也形成了极少量的子囊果。

关键词灰绿曲霉;盐度胁迫;细胞发育;真菌形态;VeA蛋白

中图分类号Q936

文献标志码:A

收稿日期2017-08-09

基金项目国家自然科学基金(41306121);中央高校基本科研业务费(22A201514040)

作者简介李佳欣(1989-),男,河南洛阳人,硕士生,研究方向为霉菌生物技术。 E-mail: 657553342@qq.com

通信联系人蔡孟浩,E-mail: cmh022199@ecust.edu.cn

文章编号1006-3080(2018)05-0650-11

DOI:10.14135/j.cnki.1006-3080.20170809003

Function Analysis of AgveA Responsed to Salt-Stress in Marine-Derived Aspergillus glaucus

LI Jia-xin,LIU Shao-mei,REN Yan-na,ZHOU Xiang-shan,CAI Meng-hao,ZHANG Yuan-xing

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai200237,China)

Abstract:Marine environment with high pressure, high salt, hypoxia and low light intensity is quite different from that of the land, which allows that marine microorganisms often have special physiology, growth and production behaviors.Aspergillus glaucusHB1-19 is a typical marine-derived fungus that can tolerate high salt stress. The developmental pattern of filamentous fungi usually switches between an asexual and sexual mode, correlating with secondary metabolism and switching in response to numerous environmental signals including light, ambient pH, nutrient availability, temperature, and osmolality. Our previous results showed that salt stress inhibited its sexual development but promoted asexual one at the same time. Filamentous fungi easily response to light signal and regulate cell development. A global regulation factor VeA and its protein complex related proteins of FphA, LreA and LreB usually function in this physiological process. This work aims to investigate whether or not the VeA protein responses to salt stress signal and regulates the cell development transitions. Genome walking is firstly used to clone the flanking gene sequences ofAgveA,AgfphA,AglreAandAglreB, and then introns of these genes are confirmed by reverse transcription. The results of qRT-PCR show that the transcription ofAgveAis obviously up-regulated by salt stress, whileAgfphA,AglreAandAglreBare down-regulated. Afterwards,AgveAis knocked out and a gene deficient strain of ΔAgveAis constructed to further study the functions ofAgveAinA.glaucus. The morphology of mycelial morpholo and colony, mycelial growth rate and cell development phonotypes are evaluated. The mycelial morphology is little changed while some edge defects are found in colonies. Mycelial growth rate accelerates in the late stages of development. Deletion ofAgveAresults in the blockage in production of cleistothecia under high salt stress, while it produces many conidiosprores and simultaneously a spot of cleistothecia under low salt stress.

Key words: Aspergillus glaucus; salt-stress; cell development; fungal morphology; VeA

近年来,海洋丝状真菌(霉菌)逐渐成为新型药源化合物的重要来源之一[1-2]。和陆地相比,海洋具有独特的高盐度环境,因此海洋微生物往往能够适应较为剧烈的盐度变化,并具备相应的应答机制。对于海洋霉菌而言,发育变化是其响应盐度变化的重要生理特征,且发育与次级代谢紧密相关[3]。霉菌发育调控的分子机制研究对于阐释发育与次级代谢之间的内在联系并调控次级代谢至关重要[3]

海洋灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)HB1-19是分离自我国南海红树林根部集落的一株海洋真菌。与陆生模式霉菌——构巢曲霉(Aspergillus nidulans)等典型霉菌相比,海洋灰绿曲霉耐受盐度范围很广,具有独特的海洋菌特性。前期盐度胁迫实验表明[4]:在利于常规陆生霉菌有性发育的黑暗条件下,高盐环境(人工海水或等渗NaCl溶液)能促使海洋灰绿曲霉进行无性发育,产生大量灰绿色的分生孢子(Conidiospore);而低盐环境(去离子水)有利于其有性发育,形成大量黄色的子囊果(Cleistothecium)。与此同时,人工海水也显著地促进了该菌株合成抗肿瘤化合物灰绿霉素A[4]。霉菌发育易受环境条件的影响,如碳源、温度、光照等,且相关的分子调控机制的研究已有很多[5],但目前鲜有关于盐度胁迫调控霉菌发育转变的分子机制的相关文献。我们的前期研究[6]发现,与发育密切相关的海洋灰绿曲霉全局调控因子VeA及其复合体组成蛋白(FphA、LreA、LreB)与陆生构巢曲霉具有高度的同源性,而且该菌响应常规环境(如光照)的发育表型变化规律也与构巢曲霉一致。然而不同的是,盐度胁迫明显改变了海洋灰绿曲霉原有的发育特性:在利于有性发育的黑暗条件下,盐度胁迫促使其进行无性发育[5]

Velvet家族蛋白VeA是丝状真菌中普遍存在的全局调控因子,参与丝状真菌发育和次级代谢等重要的生命过程调节,且在丝状真菌中非常保守[7-8]。VeA很可能直接参与调控无性发育信号转导途径,影响无性发育[9]。目前已经证明,VeA在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)[10-12]、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)[13]、轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)[14]、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)[15]等的发育调控中均发挥关键作用,其分子作用机制主要与亚细胞定位、蛋白复合体形成有关。Purschwitz等[16-17]研究发现构巢曲霉VeA在细胞核内与光感应蛋白形成蛋白复合体而发挥功能。FphA可以直接与VeA结合,其中四吡咯生色结合半胱氨酸(Chr)对该复合体结构和功能的维持至关重要。LreA与LreB相结合,并通过LreB与FphA结合。LreA和LreB可以激活有性发育,而FphA与LreA和LreB相互作用而抑制有性发育并激活无性发育[17]。目前,其协同调节机制仍有待更深入解析[7,9,18]

本文通过分析不同盐度条件下,海洋灰绿曲霉VeA蛋白复合体相关基因AgveAAgfphAAglreAAglreB的转录时序变化规律,并通过基因缺失分析AgveA调控菌丝及菌落形态、菌丝生长速率及细胞发育的功能,以此探索海洋灰绿曲霉中VeA调控细胞发育的作用及与盐度胁迫之间的关系,同时为通过人工发育调控来实现次级代谢调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与质粒 海洋灰绿曲霉(Aspergillus glaucusHB1-19)(保藏编号:CCTCC M 206022)由中国海洋大学顾谦群教授馈赠。大肠杆菌 (Escherichia coli) TOP10菌株、PUC18载体由本课题组保藏。

1.1.2 主要实验试剂 Premix PrimeSTAR MAX、Premix LATaqVersion 2.0、DNA Ligation Kit Ver.2、Genome Walking Kit、PrimeScriptTMRT Reagent Kit、DNA Ligation Kit Ver. 2.0和RNAiso Plus购自宝生物工程(大连)有限公司。EsTaqMasterMix购自北京康为世纪生物科学有限公司。ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司。PfuPCR MasterMix、DNA Marker Ⅲ、λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker、Loading Buffer、Universal DNA Purification Kit、Plant Genomic DNA Kit、RNAprep Pure Plant Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit购自北京天根生化科技有限公司。各种限制性内切酶购自美国NEB公司。FastStart Universal SYBR Green Master购自罗氏公司。RT-PCR试剂盒购自TOYOBO。抗生素Zeocin购自Invitrogen公司。

1.1.3 培养基及培养条件 海洋灰绿曲霉种子培养基、MEA (Malt Extract Agar)培养基、MEAS (Malt Extract Agar with Sea water)培养基、MM (Minimal Medium)培养基、人工海水、硝酸盐混合液、微量元素混合液、大肠杆菌LB (Luria-Bertani)培养基,本课题组前期已报道[19]。MMS (Minimal Medium with Sea water)培养基:用人工海水代替去离子水,培养基中其他成分同MM培养基;MMN (Minimal Medium with NaCl solution)培养基:含氯化钠 29.8 g/L,培养基中其他成分同MM培养基。博莱霉素(Zeocin)在高盐条件下失效,不可用人工海水配制。海洋灰绿曲霉HB1-19固体培养时,将105个分生孢子均匀涂布于固体培养基,在28 ℃静置培养4 d(按具体需求可选择避光或不避光);液体培养时置于28 ℃、180 r/min摇床上进行震荡培养。大肠杆菌固体培养时,将菌液均匀涂布于LB固体培养基,37 ℃倒置培养;液体培养时采用LB液体培养基并置于37 ℃、200 r/min摇床上进行震荡培养[20]

1.2 实验方法

1.2.1 基因组提取[21]将海洋灰绿曲霉在28 ℃、180 r/min下进行液体培养24 h后,使用布氏漏斗真空抽滤获得新鲜菌丝。刮取适量菌丝于研钵中,添加液氮反复研磨至细小粉末。然后,采用Plant Genomic DNA Kit提取基因组。

1.2.2 染色体步移 按照Genome Walking Kit所述,以简并PCR获得的序列为模板,使用Primer Premier 5.0软件对基因上下游各设计3条特异性引物(表1),进行3轮PCR扩增并回收目的条带及测序,将测序结果与原始片段进行比对拼接以确定目标DNA序列。具体PCR反应体系及程序参照Genome Walking Kit的标准要求。

1 染色体步移PCR引物列表
Table1 List of PCR primers for genome walking

Name of PrimersSequences (5’ to 3’)AgveA-SP1-upTTCAGTTAGCCTTCCCTTTCTTTAgveA-SP2-upGCTCTGGCACGCTCAGGTTAgveA-SP3-upGGTTGCTGCATGACACTGAGCTAgveA-SP1-downGTGATACCCGCGATGAGATGGAgveA-SP2-downCATACAAGCGAGCCAACGGAgveA-SP3-downCATGAAGATTCCGCCGACTTAgfphA-SP1-upCCATCTCATCCGGCCTCGCCTAAgfphA-SP2-upTCAACCGAGACGACAGAGCAgfphA-SP3-upGTTAACACCAGCTTTCTCCGAgfphA-SP1-downAGCAAGATTATCCAAAAGCAgfphA-SP2-downGCATATCGTGCGGATTGTAAgfphA-SP3-downCCGTCACAGCTCACTACCTAGAglreA-SP1-upATTTCGGTCACTATCAGAATGTAglreA-SP2-upTGGATCTTGAACGGTTTGCAglreA-SP3-upAGTCATCGAACCCGCTCATAglreA-SP1-downATGCCACACAAAGAACACGCCGAglreA-SP2-downTAATAGTTGTGGGTTACGGTGGGAglreA-SP3-downAGAGATCGGAATCTGGTTGAAglreB-SP1-upATGTCCTTCATCTCAGCTATTGAglreB-SP2-upCATGCGCTGAGCTTGTATTGTAglreB-SP3-upTGTCTTATAGAAGCAGGCTTCATAglreB-SP1-downGTGGATGTAAGTTGGTCACCTTAglreB-SP2-downCGCCAGACACCACCAACCTAglreB-SP3-downTCTTGACTCCAGTTGTATAG

1.2.3 序列分析 采用SoftBerry在线软件进行序列分析,以预测基因编码区和内含子。采用软件ClustalX和MEGA 3.1构建进化树。

1.2.4 RNA抽提及逆转录 使用RNeasy Plant Mini Kit抽提RNA,使用RT-PCR试剂盒逆转录为cDNA。

1.2.5 基因转录分析 取野生型海洋灰绿曲霉 3×108个分生孢子接种于100 mL种子培养基(500 mL摇瓶),在28 ℃、180 r/min下培养24 h;用G1砂芯漏斗真空抽滤获得新鲜菌丝,并用适量无菌水反复清洗;将洗净的新鲜菌丝加入少量无菌水,用移液器小心反复吹打至形成均匀的糊状物质;吸取适量菌丝混合物至固体平板表面,用无菌涂布棒轻轻平铺糊状菌丝,向平板中加入15颗无菌玻璃珠(直径3~4 mm),将菌丝涂布均匀;移除玻璃珠,将所有平板置于避光的28 ℃恒温培养箱中正置培养;每隔12 h取出不同培养条件的平板各1块,用无菌药匙刮取部分菌丝放入Eppendorf管中,并迅速用液氮冷却及保存于-80 ℃冰箱,用于RNA提取及逆转录。以海洋灰绿曲霉的β-微管蛋白基因AgbenA为内参,检测基因AgveA,AgfphA,AglreA,AglreB在不同盐度胁迫条件下不同时间点的转录水平。每个样品3个平行,所用引物如表2所示。PCR反应体系条件为:cDNA 1 μL;SYBR Green Mix 10 μL;Primer-F 0.5 μL;Primer-R 0.5 μL;ddH2O 8 μL。

2 基因转录分析所用引物
Table2 Primers for gene transcription analysis

PrimerSequence (5’ to 3’)AgbenA-FTGTCTACAATGGCTCCTCAgbenA-RGGGACATATTTGTTGTTGGAAgveA-FCGATCTCATACACCCTCAAAgveA-RGTATTCACTGCCGCTAGAAgfphA-FATTATTCGGTGCTGACTACAgfphA-RCCTGAGAGTGAGTGAGTTAglreA-FGTGTTCCTCTACCTTTCCAglreA-RGGCAGATTGATGATAATGTCAglreB-FGAGGAAGAGGAGGAGGAATCAglreB-RCTTGTTGCTGCTGCTTGA

1.2.6 基因敲除及原生质体制备与转化 采用EcoRI/XbaI对pUC18质粒进行双酶切并回收产物;以质粒pUC-LZ[22]为模板、zeocin-F/R为引物对扩增Sh ble基因表达盒;以引物对Upstream-F’/R克隆5’端带有质粒片段同源序列的上游同源臂;以引物对Downstream-F/R’ 克隆3’端带有Sh ble表达盒同源序列的下游同源臂;最后通过无缝克隆试剂盒对这4个DNA片段的组装而构建成打靶质粒pKV,并通过测序验证质粒争取。以质粒pKV为模板、Upstream-F/Downstream-R为引物对,克隆含有“上游同源臂-Sh ble抗性基因表达盒-下游同源臂”的DNA片段,回收该片段进行原生质体转化。原生质体制备与转化的具体实验流程见参考文献[22]。所用引物见表3。

1.2.7 孢子PCR验证 通过孢子PCR初步筛选可能的阳性转化子,具体实验流程见参考文献[19]。

1.2.8 转化子筛选 将转化子转接至30 mL种子培养基(含400 μg/mL zeocin),于 28 ℃、180 r/min摇床上培养1~2 d,抽滤菌丝并提取基因组进行PCR验证。

3 质粒及菌株构建所用引物

Table3 Primers used for construction of knock-out plasmids and strains

PrimersSequence (5’ to 3’)zeocin-FATGCCAGTTGTTCCAGTGATzeocin-RCTCGAGTGGAGATGTGGAGTUpstream-FCGCCACAGTGGGACTACTAAUpstream-RTTTGGGTTGGTATATCTGTCTAACUpstream-R’ATCACTGGAACAACTGGCATTTTGGGTTG-GTATATCTGTCTAACDownstream-FATGGGATGGAATTGATGTCTATDownstream-RTTCTGTTTCCGCACCTCCDownstream-F’ACTCCACATCTCCACTCGAGATGGGATG-GAATTGATGTCTATE_pUC18_X-FCCTGCAGGTCGACTCTAGAGE_pUC18_X-RATGACCATGATTACGAATTCveA_s-FTGTTAGACAGATATACCAACCCAAveA_s-RGCAGCCTTGTTCAGCGATAzeo_s-FGGGTCTGGCGTTGAGGATGTCzeo_s-RCCGTCCGCTTGCTCATTACATveA-FATGGCGACGCGAATGCveA-RACTAGAAAAAGTCGGCGGAATCknock-veA-QYZ-FAATCCCACCAGTGAGGTTCknock-veA-QYZ-RCACAAGCCTCGTATGACCTknock-veA-HYZ-FTGCCTAGTGAATGCTCCGTAAknock-veA-HYZ-RGCTGTTCAGGTTCCTCGTCTTknock-veA-long-FTTGACTAAGTCTCGCCATTCCknock-veA-long-RGCTCTGCCATTGTCTCGTTT

1.2.9 菌丝形态 取灭菌后的载玻片置于培养皿中。加热固体培养基使其融化,用移液器吸取300 μL,缓缓地滴加到载玻片表面,待其稍冷将无菌盖玻片轻放于培养基上,使上表面呈现一层平面,保证孢子萌发出的菌丝都能呈现在同一个平面上。待固体培养基凝固成型,用镊子将盖玻片推至一边。配制分生孢子悬液(1 mL悬液约含105个孢子),混匀后取 0.5 μL滴于固体培养基表面。封盖培养皿,28 ℃恒温避光正置培养24 h。取出培养皿,在超净台中将盖玻片小心放于固体培养基的表面,轻轻按压,通过荧光倒置显微镜观察菌丝的形态并拍照。

1.2.10 菌体生长速率及菌落形态 配制海洋灰绿曲霉野生株和缺失株的孢子悬液(1 mL悬液约含106个孢子),混匀后各吸取5 μL滴于固体培养基的中心,置于恒温培养箱,28 ℃避光正置培养。每隔24 h将培养皿取出1次,用游标卡尺测量菌落的直径,直到96 h。

1.2.11 子囊果及分生孢子计数 制备分生孢子悬液,用移液器吸取60~100 μL液体(约含5×106个孢子),滴加在固体培养基的表面,同时向培养皿中加入10个玻璃珠(直径3~4 mm),使其孢子悬液涂布均匀。然后,倒出所有玻璃珠,封盖培养皿,置于恒温培养箱,28 ℃避光正置培养96 h。向培养皿中加入10 mL无菌水,用无菌涂布棒小心刮取培养基表面的分生孢子及子囊果,将此混合液回收至50 mL离心管中并测量体积。用移液器将混合悬液吹打混匀后,用血球计数板计数,并换算出分生孢子及子囊果的数目。

2 实验结果

2.1 基因AgveA、AgfphA、AglreA和AglreB侧翼序列获取、内含子鉴定及相关进化树分析

本课题组前期研究中,通过简并PCR、基因组走读方法和Softberry软件初步获得了海洋灰绿曲霉中VeA蛋白复合体相关基因AgveAAgfphAAglreAAglreB,然而,相关基因的编码区全长及内含子却没有鉴定,且软件计算分析结果无法保证完全准确[6]。本文设计了特异性引物以通过逆转录得到cDNA,并以此为基础扩增PCR产物进行测序分析。结果表明,AgveA基因全长 1 743 bp,仅有一个内含子,位于149~202 bp,编码蛋白大小为562 个氨基酸;AgfphA基因全长 3 732 bp,没有内含子,编码蛋白大小为 1 243 aa;AglreA基因全长 2 724 bp,存在3个内含子,分别位于692~750 bp、849~904 bp和 1 344~1 393 bp,编码蛋白大小为852 aa;AglreB基因全长 1 245 bp,没有内含子,编码蛋白大小为414 aa。其中,AgveAAglreA基因序列与原始预测[6]不完全一致。在此基础上,将相关序列提交至GenBank数据库:AgveA(GenBank accession number KP729991)、AgfphA(GenBank accession number KP729992)、AglreA(GenBank accession number KP729993)和AglreB(GenBank accession number KP729994)。同时,为便于进行后续的基因敲除分析,本文进一步通过基因组走读方法克隆了4个基因的侧翼序列各 2 000~3 000 bp。

将4种基因编码蛋白的氨基酸序列在Mega 5.0 软件中与NCBI数据库中其他菌株来源的同源蛋白进行多重比对,并依据邻接法(Neighbor-Joining)分析进化关系及构建进化树(图1)。由图1可知,海洋灰绿曲霉HB1-19与曲霉属陆生菌株保持较近的亲缘关系,尤其是A.nidulans。因此,这几种蛋白的功能及其相互作用方式也可能与A.nidulans相似。

2.2 不同盐度胁迫条件下的基因转录时序变化规律

前期研究结果表明,不同盐度胁迫条件下海洋灰绿曲霉的发育状况不同,海洋灰绿曲霉无性发育强度呈现NaCl溶液(人工海水等渗溶液)>人工海水>去离子水的规律,有性发育则恰好相反[4]。为探究盐度胁迫引发的细胞发育转变是否与VeA蛋白复合体相关基因AgveAAgfphAAglreAAglreB的调控有关,进一步分析了不同盐度条件下的基因转录时序变化规律。提取不同盐度胁迫条件下(MM、MMS、MMN培养基)、不同时间点(0、0.5、1、1.5、2、2.5 d)样品的RNA,逆转录成cDNA后,针对AgveAAgfphAAglreAAglreB这4个基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验,结果如图2所示。

4个基因的转录分析都是以0时的转录量为基准值,从图2可以看出,0~0.5 d时转录量略有上升,1 d时转录量出现了小幅度下降。原因可能为当菌丝处于液体培养时,条件适宜、营养成分充足,各个基因都能够正常表达。当菌丝被抽滤并平铺在固体培养基的表面时,菌丝需要一段时间适应新环境。这个阶段的前期,菌丝细胞内原有的一部分营养成分继续被利用,使部分基因的转录仍然呈现上升的趋势。而在该阶段的后期,原有的营养成分被大量消耗,新的环境适应期尚未渡过,基因的转录水平可能处于下降的状态。当菌丝适应了新环境后,生理特性又恢复到正常水平,继续进行各基因的正常转录。

AgveA经过大约1 d的适应期后,不同盐度胁迫条件下的转录量均逐渐增多,其中,人工海水和等渗NaCl溶液条件下的AgveA转录量差异不明显。去离子水条件下的转录量在适应期刚刚结束时仅处于一个较低水平,但在1.5~2 d时迅速增加,超过了另外两个条件下的转录量,结合该条件下海洋灰绿曲霉强烈的有性发育倾向,说明低盐度胁迫能够促进AgveA的转录,使海洋灰绿曲霉倾向有性发育。

Values indicate the number of times (in percentages) that each branch topology was found in 2 000 replicates of a bootstrap analysis, assuming gamma-distributed rates for amino acid substitutions. The distance between branch points shows the relatedness of the sequences. The length of the scale bar is equivalent to 0.1 substitutions of amino acids per site. The four specfic proteins from A. glaucus HB 1-19 are highlighted by red frames.
图1 海洋灰绿曲霉AgveA、AgfphA、AglreA和AglreB的进化树分析
Fig.1 Phylogenetic analysis of AgveA (a), AgfphA (b), AglreA (c) and AglreB (d) in marine-derived Aspergillus glaucus

图2 AgveA (a), AgfphA (b), AglreA (c)和AglreB (d)基因复合物相关基因转录时序分析
Fig.2 Relative expression levels of AgveA (a), AgfphA (b), AglreA (c) and AglreB (d) in A. glaucus HB 1-19

AgfphA经过大约1 d的适应期后,不同盐度胁迫条件下转录量迅速增多,且呈现人工海水>等渗NaCl溶液>去离子水的规律。AglreA经过大约 1 d 的适应期后,不同盐度胁迫条件下的转录量逐渐增多,其中人工海水和等渗NaCl溶液条件下的转录量稍多,但二者差异不明显,去离子水条件下转录量偏少。AglreBAglreA的转录状况基本相同。总体而言,低盐度环境下AgveA的转录快速增强,并强于另外两条件下的转录情况,而AgfphAAglreAAglreB转录较弱。高盐度环境下AgveA转录较弱而AgfphAAglreAAglreB转录较强,说明盐度胁迫不利于AgveA的转录,而促进AgfphAAglreAAglreB的转录。

2.3 AgveA基因敲除及对菌株形态和细胞发育的影响

Red: veA-F/R; Blue: veA_s-F/R; Green: zeo_s-F/R; Yellow: knock-veA-QYZ-F/R; Brown: knock-veA-HYZ-F/R; Purple: knock-veA-long-F/R.
图3 AgveA基因缺失的PCR验证引物示意
Fig.3 Verification skeme for AgveA knock-out strain

通过很多次原生质体转化和基因敲除实验,最终积累到了126个转化子,能够在抗性培养基平板上稳定遗传的共有57个。分别刮取可稳定遗传的57个转化子的少量孢子进行孢子PCR反应,排除部分假阳性菌株。然后,对各个转化子进行扩增培养和基因组抽提,将每4个转化子的基因组进行混合,共得到12组混合基因组(Group A-L)。同时,根据AgveA基因缺失株应用的表型特性选出2株未经孢子PCR鉴定的转化子44#和57#。在此基础上,以野生株基因组为阴性对照,进行混合基因组的PCR鉴定。PCR分析的示意图及理论结果见图3。采用特异性引物对knock-veA-QYZ-F/R和knock-veA-HYZ-F/R(见表4)对混合基因组进行分析,如果采用不同引物对均有特异性条带产生,则进一步进行单个基因组的PCR鉴定。如图4(a)和(b)所示,混合基因组Group A和H初步鉴定为含有阳性转化子。然后,利用特异性引物对knock-veA-QYZ-F/R、knock-veA-HYZ-F/R和veA-F/R(表3)进行单个基因组的PCR鉴定,初步确定56#转化子很可能为阳性转化子(图4(c)~图4(e))。最后,利用56#转化子、野生菌株的基因组和引物对veA-out-F/R(表3)扩增得到涉及到同源重组区域的基因(图4(f)),回收该条带后进行测序分析,结果表明56#转化子的确为AgveA缺失菌株。

4AgveA基因缺失的PCR验证引物及扩增产物的理论大小

Table4 Primer pairs of verification skeme forAgveAknock-out strain and length of product

Primer pairLength of product/bpWild typeDelection mutantInsert mutantveA_s-F/R754—754zeo_s-F/R—621621veA-F/R1 743—1 743knock-veA-QYZ-F/R—2 614—knock-veA-HYZ-F/R—2 389—knock-veA-long-F/R6 4926 914—

2.4 基因缺失株ΔAgveA菌体形态及细胞发育分析

将不同培养条件下的野生株和缺失株的菌丝制作成片,培养24 h后,野生株和缺失株的菌丝在菌丝生长和菌丝弧度方面并未有明显差别。按照 1.2.10 节进行菌落培养,并测定不同盐度胁迫条件下不同时间点野生株和缺失株的菌落直径,结果见图5。无论对于野生株还是缺失株,其菌落大小都呈现人工海水>等渗NaCl溶液>去离子水的规律,这与实验的预期相符。海水中存在着多种无机盐,有利于海洋灰绿曲霉的生长;与人工海水渗透压相等的NaCl溶液条件下,海洋灰绿曲霉也具有较快的生长速率,同时该条件下菌落直径与人工海水条件下的直径相差并不多;去离子水条件下菌落的生长速率与另两组相差很大,说明盐度胁迫条件的确影响了海洋灰绿曲霉的菌体生长速率。同时,缺失株形成了更多、更分散、更不规则的细小菌丝,而野生株的菌落边缘较多为较平整、较规则的菌丝(图6),这说明AgveA基因可能与菌丝生长有着一定的联系。

(a~b) Mix genome DNA as template. M—Marker Ⅲ; Lane A-L—different groups (each group contains 4 individual transformants); Lane 44—transformant 44#; Lane 57—transformant 57#; Lane wt—wild type. Primer pair of knock-veA-QYZ-F/R was used in (a), Primer pair of knock-veA-HYZ-F/R was used in (b). (c~e) individual gemonic DNA as templates. Lane 21, 22, 26, 27, 29, 40, 56 and wt represent tansformants 21#, 22#, 26#, 27#, 29#, 40#, 56# and wild type, respectively. Primer pairs of knock-veA-QYZ-F/R、knock-veA-HYZ-F/R and veA-F/R were used in (c), (d), (e), respectively. (f) Gene amplification of tansformant 56# with primer pair of knock-veA-long-F/R, Marker is the λDNA HindⅡ in (f). The arrow indicates the target band.
图4 AgveA基因缺失株的PCR鉴定
Fig.4 PCR verification for AgveA knock-out strain

图5 ΔAgveA菌株与野生株菌落直径
Fig.5 Colony diameter of ΔAgveA and WT strains of A. glaucus HB1-19

细胞发育结果如图7所示。从海洋灰绿曲霉的颜色粗略地判断其发育状况:当菌苔偏黄色时,说明子囊果的数目多而分生孢子的数目少,菌株倾向有性发育;当菌苔偏灰绿色时,说明分生孢子的数目多而子囊果的数目少,菌株倾向无性发育。对分生孢子和子囊果进行计数,并计算了分生孢子及子囊果的数量以及分生孢子数量与子囊果数量的比值,以评判海洋灰绿曲霉的发育倾向性(图7)。对于野生株,无性发育强度的规律呈现为等渗NaCl溶液>人工海水>去离子水,有性发育强度则呈现出相反的规律。结果表明,等渗透压的NaCl溶液和人工海水对于海洋灰绿曲霉的发育有明显的影响。对于海洋灰绿曲霉的ΔAgveA菌株,无论在何种盐度胁迫条件下,都倾向于进行无性发育,当然无性发育的强度也存在差异,呈现出等渗NaCl溶液≥人工海水>去离子水的规律。该现象表明,基因AgveA是海洋灰绿曲霉有性发育的正向调控因子。

(a) Upper—WT colony at different time (1, 2, 3, 4 d); Lower—ΔAgveA colony at different time (1, 2, 3, 4 d); (b) Stereophotomicrograph of WT colony’s edge; (c) Stereophotomicrograph of WT colony’s edge; (d) Stereophotomicrograph of ΔAgveA colony’s edge; (e) Stereophotomicrograph of ΔAgveA colony’s edge
图6 海洋灰绿曲霉野生株和ΔAgveA菌株在MMS培养基的菌落形态
Fig.6 Colony morphology of WT and ΔAgveA strains on MMS

图7 海洋灰绿曲霉野生株与ΔAgveA菌株发育情况
Fig.7 Development of WT and ΔAgveA strains

3 讨 论

高盐环境促进海洋灰绿曲霉HB1-19进行无性发育,产生大量分生孢子,即使在利于有性发育的黑暗环境中,盐度胁迫促进无性发育的效果也极为明显,相反,低盐环境则利于其有性发育而形成大量子囊果。通过对全局调控因子AgveA及其复合体组成蛋白编码基因AgfphAAglreAAglreB的转录时序变化进行分析发现,盐度胁迫环境(人工海水和NaCl溶液)不利于AgveA的转录,但促进了AgfphAAglreAAglreB的转录。文献[11]报道,VeA蛋白是构巢曲霉有性发育的正向调控因子,同时是无性发育的负向调控因子。由进化树分析可知,海洋灰绿曲霉与构巢曲霉中VeA亲缘关系较近,而盐度胁迫下调AgveA的转录并促进无性发育的规律与构巢曲霉中veA的功能一致。虽然盐度胁迫增强了AgfphAAglreAAglreB的转录,但是由于FphA需要与VeA结合、LreA和LreB形成二聚体并与FphA结合而最终发挥调控功能[17],而由于AgveA的转录下调,蛋白复合体的形成将受到负调控,从而利于无性发育。海洋灰绿曲霉野生株无性发育强度的规律为等渗NaCl溶液>人工海水>去离子水,而ΔAgveA菌株,无论在何种盐度条件下都倾向于进行无性发育,当然无性发育的强度也存在差异,体现为等渗NaCl溶液≥人工海水>去离子水的规律。这进一步确证了海洋灰绿曲霉中AgveA来调控细胞发育,且与构巢曲霉类似,AgveA正调控有性发育而负调控无性发育。此外,FphA能够抑制VeA的核定位,从而减少VeA在细胞核中的浓度而增强无性发育和减弱有性发育[16]。因此,它们对于发育模式的调控也可能发生在蛋白相互作用水平上,而不仅仅体现在RNA水平上。尽管本文多次尝试探索不同盐度条件下AgveA的亚细胞定位差异,但是由于海洋灰绿曲霉代谢产物中含有荧光类物质,干扰了荧光蛋白的表达分析,因而无法准确观察到AgVeA的亚细胞定位情况,后续需要进行更多的探索,以建立海洋灰绿曲霉中蛋白的亚细胞定位分析方法。此外,分析AgfphAAglreAAglreB3个基因的功能对于系统评价AgVeA蛋白复合体的功能也至关重要。尽管我们同步开展了AgfphAAglreAAglreB的基因敲除工作,但遗憾的是始终无法筛选得到阳性转化子,其主要原因可能为丝状真菌的非同源末端连接修复机制(Non-homologous End Joining, NHEJ)导致同源重组效率非常低[24]。因此,改造海洋灰绿曲霉NHEJ,提高其同源重组效率,对后续更加系统的研究非常重要,目前我们正在开展相关研究工作。同时,AgveAAgfphAAglreAAglreB之间的蛋白结合和相互作用、蛋白复合体对于下游信号通路的调控作用和系统阐述它们在响应盐度胁迫过程中生物学功能也值得进一步探索。

在相同培养条件下,第1天和第2天AgveA缺失株比野生株生长慢,而第3天和第4天缺失株的菌落直径反而赶超了野生株。观察第3天和第4天时的菌丝可发现,缺失株比野生株的直径更大,主要原因在于缺失株的菌落边缘形成了更多、更分散、更不规则的细小菌丝,而野生株的菌落边缘较多为较平整、较规则的菌丝。这说明AgveA不仅调控细胞发育,同时与海洋灰绿曲霉菌丝生长也有一定的关系。有研究表明,黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)的veA基因与各自的菌丝生长存在着联系——veA基因的缺失导致黄曲霉菌落直径变大,却使寄生曲霉的生长速率明显变慢[13,22]。此外,烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中veA的过表达并未导致任何表型的明显改变,但是veA的缺失导致其在含有硝酸盐的培养基上分生孢子数的减少,提示veA对其形态发育产生调控作用的同时,也可能参与了氮源代谢[23]。轮枝样镰刀菌(F.verticillioides)的veA同源基因涉及到菌落疏水性的维持、菌丝生长速率、大分生孢子与小分生孢子比率平衡及细胞壁的形成。顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)的veA基因与菌丝的形态调控有关[14]。这些结果表明,不同的菌株中蛋白VeA功能相似但明显存在着差异,这或许提示蛋白VeA可能存在着一种灵活的进化机制,即为了使各菌株更好地适应各自的生存环境,VeA的调控作用能够进行一定程度的改变。在该海洋灰绿曲霉中,VeA可响应盐度信号调控细胞发育及菌体生长。而且,不同盐度胁迫条件下,ΔAgveA菌株发育的表型依旧存在着差异,也说明可能存在着一条不涉及蛋白VeA的调控通路能够感受外界信号,对海洋灰绿曲霉的无性发育产生调控作用。同时,尽管AgveA基因被缺失,但ΔAgveA菌株在低盐度条件下仍产生了极少量的有性子囊果,说明在海洋灰绿曲霉中AgveA基因的缺失并未完全阻断有性发育。

由于盐度胁迫促进了海洋灰绿曲霉的无性发育,同时也促进了抗肿瘤化合物灰绿霉素A的合成[4],而AgveA又在该过程中起到了重要的调控作用,因此,这也对人工调控AgveA的表达以实现发酵过程中灰绿霉素A的高产量提供了重要的参考。例如,可以通过诱导启动RNAi干扰使AgveA在特定培养阶段处于沉默状态,从而既不影响菌株的生长又可以在特定时间点增强产物合成,提高发酵效率。该研究对丝状真菌尤其是海洋真菌中VeA功能研究提供了一定的参考,同时为海洋灰绿霉素A的合成调控提供了一条新的思路。

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